Column Chromatography - Instrumental Methods of Analysis B. Pharma 7th Semester

కాలమ్ క్రోమాటోగ్రఫీ

కంటెంట్‌లు

•       కాలమ్ క్రోమాటోగ్రఫీ

•       సూత్రం ప్రమేయం

•       కాలమ్ క్రోమాటోగ్రఫీ యొక్క ఆచరణాత్మక అవసరాలు

•       నిశ్చల దశ (అడ్సోర్బెంట్)

•       మొబైల్ దశ

•       కాలమ్ లక్షణాలు

•       కాలమ్ తయారీ

•       నమూనా పరిచయం

•       అభివృద్ధి సాంకేతికత (ఎల్యూషన్)

•       భాగాల గుర్తింపు

•       భాగాల రికవరీ

•       కాలమ్ సామర్థ్యాన్ని ప్రభావితం చేసే అంశాలు

•       అప్లికేషన్లు

లక్ష్యాలు

ఈ సెషన్ ముగిసే సమయానికి, విద్యార్థులు వీటిని చేయగలరు:

Ø  కాలమ్ క్రోమాటోగ్రఫీని నిర్వచించండి

Ø  కాలమ్ క్రోమాటోగ్రఫీలో ఉన్న సూత్రాన్ని వివరించండి

Ø  కాలమ్ క్రోమాటోగ్రఫీ యొక్క ఆచరణాత్మక అవసరాలను వివరించండి

Ø  కాలమ్ క్రోమాటోగ్రఫీ ద్వారా సమ్మేళనం యొక్క పరిమాణాత్మక అంచనాకు సంబంధించిన విధానాన్ని వివరించండి 

Ø  కాలమ్ క్రోమాటోగ్రఫీ యొక్క భాగాలను చర్చించండి

Ø  కాలమ్ సామర్థ్యాన్ని ప్రభావితం చేసే కారకాలను చర్చించండి

Ø  కాలమ్ క్రోమాటోగ్రఫీ యొక్క లాభాలు మరియు నష్టాలను వివరించండి

కాలమ్ క్రోమాటోగ్రఫీ 

•       నిశ్చల దశ యొక్క కాలమ్ ఉపయోగించబడుతుంది

•       నిశ్చల దశ ఘనమైనది- కాలమ్ అధిశోషణం క్రోమాటోగ్రఫీ

•       నిశ్చల దశ ద్రవం- కాలమ్ విభజన క్రోమాటోగ్రఫీ

•       నిలువు విభజన క్రోమాటోగ్రఫీ విస్తృతంగా ఉపయోగించబడదు

 

సూత్రం

•       ఘన నిశ్చల దశ మరియు ద్రవ మొబైల్ దశ ఉపయోగించబడుతుంది

•       విభజన సూత్రం అధిశోషణం

•       మొబైల్ దశలో కరిగిన భాగాల మిశ్రమం కాలమ్‌లో పరిచయం చేయబడింది

•       వ్యక్తిగత భాగాలు వాటి సాపేక్ష అనుబంధాలను బట్టి వేర్వేరు రేట్లతో కదులుతాయి

•       నిశ్చల దశ పట్ల తక్కువ అనుబంధం ఉన్న సమ్మేళనాలు వేగంగా కదులుతాయి మరియు ముందుగా తొలగించబడతాయి

•       నిశ్చల దశ పట్ల ఎక్కువ అనుబంధం ఉన్న భాగం నెమ్మదిగా కదులుతుంది మరియు తరువాత తొలగించబడుతుంది

•       సమ్మేళనాలు వేరు చేయబడ్డాయి

•       నిశ్చల దశ మరియు ద్రావణం మధ్య పరస్పర చర్య యొక్క రకం ప్రకృతిలో రివర్సబుల్

•       భాగం యొక్క కదలిక రేటు ఇలా ఇవ్వబడింది

•       R = భాగం యొక్క కదలిక రేటు / మొబైల్ దశ యొక్క కదలిక రేటు

•       గా సరళీకరించవచ్చు

•       R = ద్రావకం ద్వారా కదిలే దూరం / ద్రావకం ద్వారా కదిలే దూరం 

ప్రాక్టికల్ అవసరాలు

•       నిశ్చల దశ (అడ్సోర్బెంట్)

•       మొబైల్ దశ

•       కాలమ్ లక్షణాలు

•       కాలమ్ తయారీ

•       నమూనా పరిచయం

•       అభివృద్ధి సాంకేతికత (ఎల్యూషన్)

•       భాగాల గుర్తింపు

•       భాగాల రికవరీ

నిశ్చల దశ

•       కాలమ్ క్రోమాటోగ్రఫీలో ఉపయోగించే యాడ్సోర్బెంట్

కింది ప్రమాణాలకు అనుగుణంగా ఉండాలి

•       కణ పరిమాణం మరియు జ్యామితి

•       కణాలు ఏకరీతి పరిమాణం పంపిణీని కలిగి ఉండాలి మరియు గోళాకార ఆకారాన్ని కలిగి ఉండాలి

•       కణ పరిమాణం - 60-200 μm

•       అధిక యాంత్రిక స్థిరత్వం కలిగి ఉండాలి

•       జడంగా ఉండాలి మరియు ద్రావణం లేదా ఇతర భాగాలతో ప్రతిస్పందించకూడదు

•       ఉపయోగించిన ద్రావకాలు లేదా మొబైల్ దశలో కరగదు

•       జోన్‌ల పరిశీలన మరియు భాగాల రికవరీని సులభతరం చేయడానికి రంగులేనిదిగా ఉండాలి

•       మొబైల్ దశ యొక్క ఉచిత ప్రవాహాన్ని అనుమతించాలి

కింది ప్రమాణాలకు అనుగుణంగా ఉండాలి

•       అనేక రకాల సమ్మేళనాలను వేరు చేయడానికి ఉపయోగకరంగా ఉండాలి

•       ఉచితంగా అందుబాటులో ఉండాలి, చవకైనవి మొదలైనవి

యాడ్సోర్బెంట్స్ రకాలు

బలహీనమైన	మధ్యస్థం	బలమైన
సుక్రోజ్	కాల్షియం కార్బోనేట్	యాక్టివేటెడ్ మెగ్నీషియం సిలికేట్ (సిలికా జెల్)
స్టార్చ్	కాల్షియం ఫాస్ఫేట్	సక్రియం చేయబడిన అల్యూమినా
ఇనులిన్	మెగ్నీషియం కార్బోనేట్	ఉత్తేజిత కర్ర బొగ్గు
టాల్క్	మెగ్నీషియం ఆక్సైడ్	సక్రియం చేయబడిన మెగ్నీషియా
వాషింగ్ సోడా	కాల్షియం హైడ్రాక్సైడ్	ఫుల్లర్స్ ఎర్త్

స్టేషనరీ దశ ఎంపిక

•       క్రోమాటోగ్రఫీ యొక్క విజయం నిశ్చల దశ యొక్క సరైన ఎంపికపై ఆధారపడి ఉంటుంది

•       స్థిర దశ ఎంపిక ఆధారపడి ఉంటుంది

మలినాలను తొలగించడం

•       చిన్న పరిమాణంలో అశుద్ధం ఉంది మరియు అనుబంధంలో తేడా ఉంటుంది

•       బలహీనమైన యాడ్సోర్బెంట్ ఉపయోగించబడుతుంది

వేరు చేయవలసిన భాగాల సంఖ్య

•       కొన్ని భాగాలు వేరు చేయబడాలి- బలహీనమైన యాడ్సోర్బెంట్ ఉపయోగించబడుతుంది

•       మరిన్ని భాగాలు వేరుచేయబడతాయి- బలమైన యాడ్సోర్బెంట్ ఉపయోగించబడుతుంది

భాగాల మధ్య అనుబంధ వ్యత్యాసం

•       సారూప్య అనుబంధాలు కలిగిన భాగాలు- బలమైన శోషణం

•       అనుబంధాలలో ఎక్కువ వ్యత్యాసం- బలహీనమైన యాడ్సోర్బెంట్

ఉపయోగించిన నిలువు వరుస పొడవు

•       పొట్టి కాలమ్- బలమైన శోషణం

•       పొడవైన కాలమ్- బలహీనమైన యాడ్సోర్బెంట్

యాడ్సోర్బెంట్ పరిమాణం

•       ప్రభావవంతమైన విభజన కోసం యాడ్సోర్బెంట్ యొక్క 20 లేదా 30 రెట్లు బరువు ఉపయోగించబడుతుంది

•       యాడ్సోర్బేట్ : యాడ్సోర్బెంట్ నిష్పత్తి = 1:20 లేదా 1:30

మొబైల్ దశ

•       చాలా ముఖ్యమైనది మరియు అనేక విధులను అందిస్తుంది

•       ద్రావకం, డెవలపర్ మరియు ఎలుయెంట్‌గా పని చేయండి

మొబైల్ దశ యొక్క విధులు

•       మిశ్రమాన్ని కాలమ్‌లో ప్రవేశపెట్టడానికి- ద్రావకం వలె

•       విభజన కోసం జోన్‌లను అభివృద్ధి చేయడానికి- అభివృద్ధి చెందుతున్న ఏజెంట్‌గా

•       కాలమ్ నుండి స్వచ్ఛమైన సమ్మేళనాన్ని తొలగించడానికి- ఎలుయెంట్‌గా

•       వివిధ మొబైల్ దశలు ఉపయోగించబడతాయి- ధ్రువణత లేదా ఎలుషన్ బలం యొక్క పెరుగుతున్న క్రమంలో

•       పెట్రోలియం ఈథర్, కార్బన్ టెట్రాక్లోరైడ్, సైక్లోహెక్సేన్, కార్బన్‌డిసల్ఫైడ్, ఈథర్, అసిటోన్, బెంజీన్, టోలున్, ఇథిలాసెటేట్, క్లోరోఫామ్, ఆల్కహాల్ (మిథనాల్, ఇథనాల్ మొదలైనవి), నీరు, పిరిడిన్, సేంద్రీయ ఆమ్లాలు (ఎసిటిక్ ఆమ్లం మొదలైనవి)

•       స్వచ్ఛమైన రూపంలో లేదా వివిధ కూర్పుల ద్రావకాల మిశ్రమంగా ఉపయోగించవచ్చు

కాలమ్ లక్షణాలు

•       కాలమ్ యొక్క మెటీరియల్ ఎక్కువగా మంచి నాణ్యత గల తటస్థ గాజు

•       ద్రావకాలు, ఆమ్లాలు లేదా క్షారాల ద్వారా ప్రభావితం చేయకూడదు

•       సాధారణ బ్యూరెట్‌ను వేరు చేయడానికి కాలమ్‌గా కూడా ఉపయోగించవచ్చు

•       ప్రభావవంతమైన విభజన కోసం కాలమ్ కొలతలు ముఖ్యమైనవి

•       పొడవు:వ్యాసం 10:1 నుండి 30:1 వరకు ఉంటుంది

•       మరింత సామర్థ్యం కోసం 100:1ని కూడా ఉపయోగించవచ్చు

నిలువు వరుస యొక్క పొడవు ఆధారపడి ఉంటుంది

•       యాడ్సోర్బెంట్ పట్ల సమ్మేళనాల అనుబంధం

•       వేరు చేయవలసిన సమ్మేళనాల సంఖ్య

•       ఉపయోగించిన యాడ్సోర్బెంట్ రకం

•       నమూనా పరిమాణం

కాలమ్ యొక్క తయారీ

•       కాలమ్ దిగువ భాగం కాటన్ ఉన్ని లేదా గాజు ఉన్నితో ప్యాక్ చేయబడింది లేదా ఆస్బెస్టాస్ ప్యాడ్ కలిగి ఉండవచ్చు

•       దాని పైన యాడ్సోర్బెంట్ యొక్క కాలమ్ ప్యాక్ చేయబడింది

•       Whatmann ఫిల్టర్ పేపర్ డిస్క్ కూడా ఉపయోగించబడుతుంది

•       నిలువు వరుసను ప్యాక్ చేసిన తర్వాత, ఇదే పేపర్ డిస్క్ పైభాగంలో ఉంచబడుతుంది

•       శాంపిల్ లేదా మొబైల్ ఫేజ్‌ని ప్రవేశపెట్టేటప్పుడు యాడ్సోర్బెంట్ లేయర్‌కు భంగం కలగదు

•       యాడ్సోర్బెంట్ పొరలో ఆటంకం వేరులో క్రమరహిత బ్యాండ్‌లకు దారి తీస్తుంది

రెండు రకాల ప్యాకింగ్ పద్ధతులు అందుబాటులో ఉన్నాయి

•       డ్రై ప్యాకింగ్ టెక్నిక్

•       తడి ప్యాకింగ్ టెక్నిక్

డ్రై ప్యాకింగ్

•       ఇక్కడ, అవసరమైన పరిమాణంలో యాడ్సోర్బెంట్ పొడి రూపంలో కాలమ్‌లో ప్యాక్ చేయబడుతుంది

•       సమతౌల్యం సాధించే వరకు ద్రావకం కాలమ్ గుండా ప్రవహించడానికి అనుమతించబడుతుంది

ఈ సాంకేతికత యొక్క ప్రతికూలతలు 

•       గాలి బుడగలు ద్రావకం మరియు స్థిర దశ మధ్య చిక్కుకున్నాయి

•       నిలువు వరుస ఏకరీతిగా ప్యాక్ చేయబడకపోవచ్చు

•       కాలమ్‌లో ఉన్న యాడ్సోర్బెంట్‌లో పగుళ్లు కనిపిస్తాయి

•       ప్రవాహ లక్షణాలలో ఏకరూపత లేదు మరియు

•       వేరు చేయబడిన భాగం యొక్క స్పష్టమైన బ్యాండ్ పొందలేకపోవచ్చు

తడి ప్యాకింగ్

•       ఆదర్శ సాంకేతికత

•       అవసరమైన పరిమాణంలో యాడ్సోర్బెంట్ ఒక బీకర్‌లో మొబైల్ ఫేజ్ ద్రావకంతో కలుపుతారు మరియు కాలమ్‌లో పోస్తారు

•       నిశ్చల దశ నిలువు వరుసలో ఏకరీతిగా స్థిరపడుతుంది

•       గాలి బుడగలు చిక్కుకోవడం లేదు

•       యాడ్సోర్బెంట్ యొక్క కాలమ్‌లో పగుళ్లు లేవు

•       నిలువు వరుస నుండి తొలగించబడిన బ్యాండ్‌లు ఏకరీతిగా ఉంటాయి

•       విడిపోవడానికి అనువైనది

నమూనా పరిచయం

•       సాధారణంగా భాగాలు మిశ్రమంగా ఉండే నమూనా మొబైల్ దశలో కనిష్ట పరిమాణంలో కరిగిపోతుంది

•       లేదా కనీస ధ్రువణత కలిగిన ద్రావకం

•       మొత్తం నమూనా ఒకేసారి కాలమ్‌లోకి ప్రవేశపెట్టబడింది

•       నిలువు వరుస ఎగువ భాగంలో శోషించబడుతుంది

•       Individual compound can be separated by process of elution

Development technique (Elution)

•       After introduction of sample, by elution techniques individual components are separated from the column

•       Isocratic elution technique

•       Gradient elution technique

Elution Techniques

Isocratic elution technique

•       Here, same solvent composition or solvent of same polarity is used throughout the process of elution

•       For example chloroform only, petroleum ether:benzene = 1:1 only, etc

Gradient elution technique

•       Here, solvents of gradually increasing polarity or

•       Increasing elution strength are used during the process of elution

•       Initially low polar solvent is used followed by gradually increasing the polarity to a more polar solvent

•       For example, initially benzene, then chloroform, then ethylacetate, then to methanol, etc

Detection of Components

•       Detection of colored components can be done visually

•       వివిధ రంగుల బ్యాండ్‌లు నిలువు వరుసలో కదులుతున్నట్లు కనిపిస్తాయి, వీటిని వెంటనే సేకరించవచ్చు

•       కానీ రంగులేని సమ్మేళనాల కోసం, సాంకేతికత భాగాల లక్షణాలపై ఆధారపడి ఉంటుంది

ఉపయోగించగల విభిన్న లక్షణాలు

•       కాంతి యొక్క శోషణ (UV/కనిపించే) - UV/Vis డిటెక్టర్ ఉపయోగించి

•       ఫ్లోరోసెన్స్ లేదా లైట్ ఎమిషన్ లక్షణాలు - ఫ్లోరోసెన్స్ డిటెక్టర్ ఉపయోగించి

•       జ్వాల అయనీకరణ డిటెక్టర్ ఉపయోగించి

•       రిఫ్రాక్టివ్ ఇండెక్స్ డిటెక్టర్

•       ద్రావకం యొక్క బాష్పీభవనం మరియు అవశేషాలను తూకం వేయడం

•       సన్నని పొర క్రోమాటోగ్రఫీ ద్వారా భిన్నాలను పర్యవేక్షించడం ద్వారా

భాగాల రికవరీ

•       మునుపు కాలమ్‌ను అనేక విభిన్న జోన్‌లుగా కత్తిరించడం ద్వారా జరిగింది

•       తరువాత, ప్లంగర్ ఉపయోగించి కాలమ్‌ను జోన్‌లుగా మార్చడం జరిగింది

•       ఎల్యూషన్ అనే ప్రక్రియ ద్వారా భాగాలను తిరిగి పొందడం ఉత్తమ సాంకేతికత

•       భాగాలను ఎలుయేట్ అంటారు

•       ఎలుయెంట్ అని పిలిచే ద్రావకం

•       కాలమ్ నుండి భాగాలను తొలగించే ప్రక్రియను ఎల్యూషన్ అంటారు

•       రికవరీ 10 ml, 20 ml, etc లేదా అసమాన వాల్యూమ్ వంటి సమాన వాల్యూమ్ యొక్క మొబైల్ దశ యొక్క విభిన్న భిన్నాలుగా సేకరించడం ద్వారా జరుగుతుంది

•       సమయం వారీగా కూడా సేకరించవచ్చు అంటే, ప్రతి 10 లేదా 20 నిమిషాలకు భిన్నం మొదలైనవి

•       చివరి స్లయిడ్‌లో చర్చించిన సాంకేతికతలను ఉపయోగించడం ద్వారా పునరుద్ధరించబడిన భిన్నాలు కనుగొనబడతాయి

•       స్వచ్ఛమైన రూపంలో బల్క్ సమ్మేళనం పొందడానికి ఇలాంటి భిన్నాలు కలపబడతాయి

కాలమ్ సామర్థ్యాన్ని ప్రభావితం చేసే కారకాలు

•       ఏదైనా విభజన కోసం, నిలువు వరుస యొక్క సామర్థ్యం ముఖ్యం

•       కాలమ్ సామర్థ్యాన్ని ప్రభావితం చేసే కారకాలు తెలియకపోతే, సామర్థ్యాన్ని మెరుగుపరచడం సాధ్యం కాదు

కాలమ్ యొక్క కొలతలు

•       పొడవు:వ్యాసం నిష్పత్తి 20:1, 30:1 అనువైనవి

•       100:1 సంతృప్తికరంగా ఉండవచ్చు

యాడ్సోర్బెంట్ యొక్క కణ పరిమాణం

•       యాడ్సోర్బెంట్ చర్య యాడ్సోర్బెంట్ యొక్క ఉపరితల వైశాల్యంపై ఆధారపడి ఉంటుంది

•       ఉపరితల వైశాల్యాన్ని పెంచడానికి, కణ పరిమాణాన్ని తగ్గించవచ్చు

•       శోషక చర్య పెరుగుతుంది

ద్రావకం యొక్క స్వభావం

•       ద్రావకం యొక్క ప్రవాహం రేటు దాని స్నిగ్ధత ద్వారా ప్రభావితమవుతుంది మరియు విలోమానుపాతంలో ఉంటుంది

•       తక్కువ జిగట ద్రావకాలు మంచి సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉంటాయి

కాలమ్ యొక్క ఉష్ణోగ్రత

•       అధిక ఉష్ణోగ్రత వద్ద ఎల్యూషన్ వేగం పెరుగుతుంది

•       కానీ అధిక ఉష్ణోగ్రతల వద్ద శోషక శక్తి తగ్గుతుంది

•       ఎలుషన్ వేగం మరియు శోషక శక్తి మధ్య బ్యాలెన్స్ చేయాలి

•       సాధారణంగా గది ఉష్ణోగ్రత అన్ని నమూనాల కోసం ఉపయోగించబడుతుంది

•       అధిక ఉష్ణోగ్రతల వద్ద కష్టమైన నమూనాలు వేరు చేయబడతాయి

 ఒత్తిడి

•       కాలమ్ పైన అధిక పీడనం మరియు

•       కాలమ్ దిగువన ఉన్న అల్పపీడనం విభజన సామర్థ్యాన్ని పెంచుతుంది

•       కాలమ్ పైన మొబైల్ ఫేజ్ రిజర్వాయర్‌ని నిర్వహించడం ద్వారా కాలమ్ పైన అధిక పీడనాన్ని సాధించవచ్చు లేదా

•       ఒత్తిడి పరికరాలను ఉపయోగించడం ద్వారా

•       వాక్యూమ్ పంప్‌ని ఉపయోగించి వాక్యూమ్‌ని వర్తింపజేయడం ద్వారా నిలువు వరుస దిగువన ఒత్తిడి తగ్గింది

అప్లికేషన్లు

•       సమ్మేళనాల మిశ్రమం యొక్క విభజన

•       మలినాలను తొలగించడం లేదా శుద్దీకరణ ప్రక్రియ

•       క్రియాశీల భాగాలను వేరుచేయడం

•       జీవ ద్రవాల నుండి జీవక్రియలను వేరుచేయడం

•       సూత్రీకరణలు లేదా ముడి పదార్ధాలలో ఔషధాల అంచనా

కాలమ్ క్రోమాటోగ్రఫీ ప్రోస్ & కాన్స్

ప్రోస్

•       ఏ రకమైన మిశ్రమాన్ని అయినా వేరు చేయవచ్చు

•       మిశ్రమం యొక్క ఏదైనా పరిమాణాన్ని వేరు చేయవచ్చు ( μg నుండి mg)

•       మొబైల్ దశ యొక్క విస్తృత ఎంపిక

•       సన్నాహక రకంలో నమూనాను వేరు చేసి తిరిగి ఉపయోగించుకోవచ్చు

•       ఆటోమేషన్ సాధ్యమే

ప్రతికూలతలు

•       సమయం తీసుకునే పద్ధతి

•       ఎక్కువ మొత్తంలో ద్రావకాలు అవసరమవుతాయి, ఇవి ఖరీదైనవి

•       ఆటోమేషన్ సాంకేతికతను మరింత క్లిష్టంగా మరియు ఖరీదైనదిగా చేస్తుంది

సారాంశం

•       నిలువు విభజన క్రోమాటోగ్రఫీ విస్తృతంగా ఉపయోగించబడదు

•       వ్యక్తిగత భాగాలు వాటి సాపేక్ష అనుబంధాలను బట్టి వేర్వేరు రేట్లతో కదులుతాయి

•       నిశ్చల దశ పట్ల తక్కువ అనుబంధం ఉన్న సమ్మేళనాలు వేగంగా కదులుతాయి మరియు ముందుగా తొలగించబడతాయి

•       క్రోమాటోగ్రఫీ యొక్క విజయం నిశ్చల దశ యొక్క సరైన ఎంపికపై ఆధారపడి ఉంటుంది

•       యాడ్సోర్బేట్ : యాడ్సోర్బెంట్ నిష్పత్తి = 1:20 లేదా 1:30

•       కాలమ్ యొక్క మెటీరియల్ ఎక్కువగా మంచి నాణ్యత గల తటస్థ గాజు

డిటెక్షన్ కోసం వివిధ లక్షణాలు ఉపయోగించబడతాయి

•       కాంతి యొక్క శోషణ (UV/కనిపించే) - UV/Vis డిటెక్టర్ ఉపయోగించి

•       ఫ్లోరోసెన్స్ లేదా లైట్ ఎమిషన్ లక్షణాలు - ఫ్లోరోసెన్స్ డిటెక్టర్ ఉపయోగించి

•       జ్వాల అయనీకరణ డిటెక్టర్ ఉపయోగించి

•       రిఫ్రాక్టివ్ ఇండెక్స్ డిటెక్టర్

•       ద్రావకం యొక్క బాష్పీభవనం మరియు అవశేషాలను తూకం వేయడం

•       సన్నని పొర క్రోమాటోగ్రఫీ ద్వారా భిన్నాలను పర్యవేక్షించడం ద్వారా

కాలమ్ సామర్థ్యాన్ని ప్రభావితం చేసే అంశాలు

•       కాలమ్ యొక్క కొలతలు

•       యాడ్సోర్బెంట్ యొక్క కణ పరిమాణం

•       ద్రావకం యొక్క స్వభావం

•       కాలమ్ యొక్క ఉష్ణోగ్రత

•       ఒత్తిడి

 PDF గమనికల కోసం డౌన్‌లోడ్ బటన్‌పై క్లిక్ చేయండి